Dalam biologi molekular, pilihan buffer yang baik dan persediaan untuk langkah pengasingan DNA yang berbeza boleh menjadi perbezaan antara beralih ke ekspresi protein atau membuka kit maxi-prep yang lain untuk memulakan. Walaupun pentingnya, resipi penimbal selalunya hanya resipi-resipi yang ditulis tanpa penjelasan atau rasional untuk komponen yang berbeza. Satu penyangga sedemikian adalah glukosa-tris-EDTA atau penyangga GTE.
$config[code] not foundApa yang digunakan oleh GTE?
GTE digunakan untuk membuang semula pelet sel bakteria sebelum lysing (membuka buka) sel-sel dan menuai DNA plasmid di dalamnya. Lysozyme, yang melembutkan membran sel, sering ditambah bersama dengan penampan GTE. Mencapai penggantungan homogen di seluruh sel-sel semasa langkah ini supaya penyelesaian lisis yang kemudiannya ditambah ke semua sel adalah kunci untuk mendapatkan hasil DNA yang baik. GTE direka untuk melakukan ini sambil menyediakan persekitaran yang stabil untuk DNA.
Glukosa untuk Osmolarity
Gula glukosa 50mM (millimolar) ditambah kepada penyangga GTE untuk mengekalkan osmolariti di mana kepekatan larut di luar sel-sel adalah berhampiran dengan sel-sel di dalam sel. Ini menghalang lisis sel pramatang, yang boleh menyebabkan hasil DNA yang lebih rendah disebabkan oleh pengagregatan dan degradasi. Komponen penimbal lain juga menyumbang kepada osmolarity penyelesaian, tetapi glukosa, yang bukan elektrolit, adalah pilihan yang baik kerana ia tidak mengganggu sifat penampan penyelesaian.
Tris untuk kestabilan pH
Tris adalah nama pendek untuk tris (hydroxymethyl) aminomethane, yang merupakan penyangga pH yang sangat biasa. Dalam kes penyangga GTE, garam asid (Tris-HCl) ditambah kepada penampan pada kepekatan 25mM. Ini mengekalkan pH larutan pada fisiologi berhampiran 8.0, pH ideal untuk mencegah hidrolisis asid (degradasi) DNA plasmid dan tindak balas sampingan yang tidak diingini dari komponen sel lain.
EDTA Menghalang Degradasi DNA
EDTA, atau asid ethylenediaminetetraacetic, menangkap atau ion logam "chelates" daripada penyelesaian, menghalang mereka daripada mengambil bahagian dalam tindak balas sampingan yang tidak diingini. Dalam penyangga GTE, EDTA ditambah pada 10mM. Tujuan utamanya ialah penimbal untuk membulatkan zink bebas, magnesium, dan kalsium, dengan itu menghalang degradasi DNA oleh laluan tertentu yang memerlukan logam tersebut.
Beberapa Tips Penting
Pastikan penampan GTE anda sejuk dan membuatnya dalam kuantiti yang kecil untuk mencegah pertumbuhan bakteria yang tidak diingini di dalamnya. Gula dan pH terkawal menjadikan medium pertumbuhan yang hebat. Sentiasa gunakan air yang disucikan. Ketuk air boleh mempunyai lebih daripada ion logam dari paip, yang boleh mengatasi keupayaan EDTA untuk ditangkap. Jika anda mengesyaki kehadiran RNA yang mengganggu dalam sampel anda, tambah RNase A pada 100 mikrogram per mililiter ke penampan GTE anda untuk menghapuskan masalah ini.
